1.Positive control反应体系配制（20 μL）
| 10 × Reaction Buffer | 2 μL |
| 10 × E1 Enzyme | 2 μL |
| 5 × Ubiquitin | 4 μL |
| 10 × Mg2+-ATP | 2 μL |
| 20 × E2 Enzyme | 1 μL |
| 10 × E3 Ligase Itch (Positive control) | 2 μL |
| 20 × S5a substrate (Positive control) | 1 μL |
| H2O | 6 μL |
2.反应条件
37℃抚育 （30min-2h，如果效果不明显可增加反应时间12h），建议使用PCR仪或金属浴
3.结果检测
（1）取样品20 μL加入5 μL的5X SDS-PAGE Buffer（加入1 μL新鲜配制的1M DTT），加热样品95℃ 5 min，随后使用还原性（含DTT）上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳分析;
（2）选择E3 Ubiquitin Ligase、泛素、Substrate抗体进行Western-blot分析。