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E2Select Ubiquitin Conjugation Kit

产品编号 规格 价格 货期
UBK-982 Kit ¥3280 现货
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此试剂盒可供体外泛素化检测,筛选E3和底物所对应的E2酶,此试剂盒包含11种常用E2.也包含阳性对照S5a和ITCH
1.试剂盒组成:(10T)

名称 体积
10 × Reaction Buffer 200 μL
10 × E1 Enzyme (His-tag) 200 μL
5 × Ubiquitin (冻干粉中加400μL水) 400 μL
10 × Mg2+-ATP 200 μL
10 × E3 Ligase Itch (Positive control) 20 μL
20 × S5a substrate (Positive control) 20 μL
10 × E2 Enzyme Set
20 × UBE2R1/UbcH3/Cdc34 (2R1) 15 μL
20 × UBE2N/UBE2V2 Complex (2N/2V2) 15 μL
20 ×UBE2D1/UbcH5a (D1) 15 μL
20 × UBE2D2/UbcH5b (D2) 15 μL
20 ×UBE2D3/UbcH5c (D3) 15 μL
20 × UBE2L3/UbcH7 (2L3) 15 μL
20 ×UBE2K/E2-25K (2K) 15 μL
20 ×UBE2C/UbcH10 (2C) 15 μL
20 ×UBE2E1/UbcH6 (E1) 15 μL
20 ×UBE2H/UbcH2 (2H) 15 μL
20 ×UBE2L6/UbcH8 (2L6) 15 μL

* -80℃保存,避免反复冻融
2.反应体系配制(20 μL)

名称 体积
10 × Reaction Buffer2 μL
10 × E1 Enzyme2 μL
5 × Ubiquitin4 μL
10 × Mg2+-ATP2 μL
20 × E2 Enzyme1 μL
E3 Ubiquitin Ligase*0.2-2 μM
Substrate (可选)*1-5 μM
H2OUp to 20 μL

*使用者自己准备,E3 Ubiquitin Ligase可重组表达或从细胞裂解液中纯化,Substrate (可选)  not required for analyzing E3 Auto-Ubiquitination.
3. Positive control反应体系配制(20 μL)

10 × Reaction Buffer2 μL
10 × E1 Enzyme2 μL
5 × Ubiquitin4 μL
10 × Mg2+-ATP2 μL
20 × E2 Enzyme1 μL
10 × E3 Ligase Itch (Positive control)2 μL
20 × S5a substrate (Positive control)1 μL
H2O6 μL

4.反应条件
37抚育 (30min-2h,如果效果不明显可增加反应时间12h,建议使用PCR仪或金属浴
5.结果检测
(1)取样品20 μL加入5 μL5X SDS-PAGE Buffer加入1 μL新鲜配制的1M DTT,加热样品95 5 min,随后使用还原性(含DTT)上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳分析;
(2)选择E3 Ubiquitin Ligase泛素Substrate抗体进行Western-blot分析。

*以上结果为试剂盒阳性对照结果,红色区域为底物蛋白S5a+nUB,发生了体外泛素化作用。